La historia gira entorno al conflicto entre dos "facciones" que lucharon entre sí por cientos de años, pero la narración del juego comienza en las cruzadas del siglo XIII.
Por un lado están los templarios, que en apariencia son una de las muchas órdenes que luchan junto a los cristianos en la Cruzada, pero su objetivo es conseguir el llamado Fruto del Edén, un artefacto antiguo con el cual pretenden apoderarse de las mentes de todas las personas y obtener una sociedad civilizada, que viva en paz, pero sin voluntades. Su maestro era Roberto de Sable, antes de que lo asesinaran.
Ambos toman contacto con un Fruto del Edén denominado como La Manzana del Edén. No obstante, durante las experiencias de Ezio, Miles descubre la existencia de más Frutos del Edén. Y es precisamente durante las aventuras protagonizadas por Miles/Ezio cuando tomamos contacto con una de las grandes revelaciones de la saga Assassin´s Creed: el fin del mundo previsto para el año 2012. Precisamente el año en el que transcurre el prólogo del primer Assassin´s Creed, y donde transcurre también la otra asentada vida de Desmond Miles/Ezio tiene conocimiento de estos datos por varias vías. Por un lado, esta profecía es mencionada por un usuario anterior del Animus al que se le conoce únicamente como Sujeto 16. Y por otro lado, esta profecía también es relatada por unas figuras holográficas pertenecientes a una especie que precedió en la Tierra a la raza humana. Estas figuras, que se hacen llamar a sí mismas como La Primera Civilización o Los Que Vinieron Antes, responden a los nombres de Minerva, Juno y Júpiter, y son los creadores de los Frutos del Eden.
